סינתזת פפטידים

מויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
קפוץ לניווט קפוץ לחיפוש

צימוד של שתי חומצות אמינו בתמיסה. האמין הבלתי מוגן של אחד מגיב עם קבוצת החומצות הקרבוקסיליות הלא מוגנת של השני ליצירת קשר פפטיד . בדוגמה זו, הקבוצה התגובתית השנייה (אמין/חומצה) בכל אחד מחומרי המוצא נושאת קבוצת הגנה .

בכימיה אורגנית , סינתזת פפטידים היא ייצור של פפטידים , תרכובות שבהן מספר חומצות אמינו מקושרות באמצעות קשרי אמיד, הידועים גם כקשרי פפטידים . פפטידים מסונתזים כימית על ידי תגובת עיבוי של קבוצת הקרבוקסיל של חומצת אמינו אחת לקבוצת האמינו של אחרת. אסטרטגיות הגנה של קבוצות נחוצות בדרך כלל כדי למנוע תגובות לוואי לא רצויות עם שרשראות הצד השונות של חומצות האמינו. [1] סינתזת פפטידים כימית מתחילה לרוב בקצה הקרבוקסילי של הפפטיד (C-terminus), ומתמשכת לכיוון האמינו-terminus ( N-terminus ).[2] ביוסינתזה של חלבון (פפטידים ארוכים) ביצורים חיים מתרחשת בכיוון ההפוך.

הסינתזה הכימית של פפטידים יכולה להתבצע באמצעות טכניקות שלב פתרון קלאסי, אם כי אלו הוחלפו ברוב הגדרות המחקר והפיתוח בשיטות שלב מוצק (ראה להלן). [3] סינתזה בשלב הפתרון שומרת על שימושיותה בייצור בקנה מידה גדול של פפטידים למטרות תעשייתיות.

סינתזה כימית מקלה על ייצור פפטידים שקשה לבטא אותם בחיידקים, שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות, שינוי עמוד השדרה של פפטיד/חלבון וסינתזה של חלבוני D, המורכבים מחומצות אמינו D.

סינתזה בשלב מוצק

השיטה המבוססת לייצור פפטידים סינתטיים במעבדה ידועה בשם סינתזת פפטידים מוצקים (SPPS). [2] חלוץ על ידי רוברט ברוס מריפילד , [4] [5] SPPS מאפשר הרכבה מהירה של שרשרת פפטידים באמצעות תגובות עוקבות של נגזרות חומצות אמינו על משטח נקבובי בלתי מסיס.

התומך המוצק מורכב מחרוזי שרף פולימריים קטנים המתפקדים עם קבוצות תגובתיות (כגון קבוצות אמין או הידרוקסיל) המקשרות לשרשרת הפפטידים המתהווה. [2] מכיוון שהפפטיד נשאר מחובר לתומך לאורך כל הסינתזה, ניתן להסיר עודפי ריאגנטים ותוצרי לוואי על ידי שטיפה וסינון. גישה זו עוקפת את הבידוד הגוזל זמן רב יחסית של פפטיד המוצר מהתמיסה לאחר כל שלב תגובה, אשר יידרש בעת שימוש בסינתזה קונבנציונלית בשלב התמיסה.

כל חומצת אמינו שתצורף ל-N-terminus של שרשרת הפפטידים חייבת להיות מוגנת בקצה ה-N ובשרשרת הצדדית שלה באמצעות קבוצות הגנה מתאימות כמו Boc (לאבילי חומצה) או Fmoc (לאבילי לבסיס), בהתאם לשרשרת הצדדית אסטרטגיית ההגנה שבה נעשה שימוש (ראה להלן). [1]

הליך ה-SPPS הכללי הוא אחד של מחזורים חוזרים ונשנים של הסרת הגנה ותגובות צימוד לסירוגין. ניתן לשטוף את השרף בין כל שלב. [2] ראשית חומצת אמינו מחוברת לשרף. לאחר מכן, האמין מסולק, ולאחר מכן מצמידים אותו לחומצה החופשית של חומצת האמינו השנייה. מחזור זה חוזר על עצמו עד לסונתז של הרצף הרצוי. מחזורי SPPS עשויים לכלול גם שלבי כיסוי החוסמים את הקצוות של חומצות אמינו שלא הגיבו מלהגיב. בסוף הסינתזה, הפפטיד הגולמי מבוקע מהתומך המוצק ובו זמנית מסירים את כל קבוצות ההגנה באמצעות מגיב חומצות חזקות כמו חומצה טריפלואוראצטית או נוקלאופיל. [2]ניתן לזרז את הפפטיד הגולמי מממס לא קוטבי כמו דיאתיל אתר על מנת להסיר תוצרים מסיסים אורגניים. ניתן לטהר את הפפטיד הגולמי באמצעות HPLC הפוך . [6] [7] תהליך הטיהור, במיוחד של פפטידים ארוכים יותר יכול להיות מאתגר, מכיוון שיש להסיר כמויות קטנות של מספר תוצרי לוואי, הדומים מאוד למוצר. מסיבה זו, מה שנקרא תהליכי כרומטוגרפיה רציפה כגון MCSGP נמצאים בשימוש יותר ויותר במסגרות מסחריות כדי למקסם את התשואה מבלי להקריב את רמות הטוהר. [8]

SPPS מוגבל על ידי תשואות תגובה , ובדרך כלל פפטידים וחלבונים בטווח של 70 חומצות אמינו דוחפים את גבולות הנגישות הסינתטית. [2] קושי סינתטי תלוי גם ברצף; בדרך כלל קשה ליצור רצפים המועדים לצבירה כגון עמילואידים [9] . ניתן לגשת לאורכים ארוכים יותר על ידי שימוש בגישות קשירה כגון קשירה כימית מקורית , שבה ניתן לחבר שני פפטידים סינתטיים קצרים יותר שהוסרו לחלוטין בתמיסה.

ריאגנטים לצימוד פפטידים

תכונה חשובה שאפשרה את היישום הרחב של SPPS היא יצירת תשואות גבוהות במיוחד בשלב הצימוד. [2] נדרשים תנאי יצירת קשר אמידים יעילים במיוחד . [10] [11] [12] והוספת עודף של כל חומצת אמינו (בין פי 2 ל-10). למזעור הגזע של חומצות אמינו במהלך הצימוד יש גם חשיבות חיונית כדי למנוע אפימריזציה במוצר הפפטיד הסופי.

יצירת קשר אמידים בין אמין לחומצה קרבוקסילית איטית , וככזו בדרך כלל דורשת 'ריאגנטים מצמדים' או 'מפעילים'. קיים מגוון רחב של ריאגנטים צימודים, בין היתר בשל יעילותם המשתנה עבור צימודים מסוימים, [13] [14] רבים מהריאגנטים הללו זמינים מסחרית.

Carbodiimides

יצירת קשר אמיד באמצעות DIC/HOBt. [12]

Carbodiimides כגון Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ודי isopropylcarbodiimide (DIC) משמשים לעתים קרובות ליצירת קשרים אמידים. [12] התגובה ממשיכה באמצעות היווצרות של אוריאה O -acyliso תגובתית מאוד . תוצר ביניים תגובתי זה מותקף על ידי הפפטיד N-terminal amine, ויוצר קשר פפטיד. היווצרות אוריאה O - acyliso מתקדמת הכי מהר בממסים לא קוטביים כמו דיכלורומתאן. [15]

DIC שימושי במיוחד עבור SPPS שכן כנוזל הוא מופק בקלות, ותוצר הלוואי של אוריאה נשטף בקלות. לעומת זאת, ה-carbodiimide 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) קשור לעתים קרובות עבור צימודי פפטיד בשלב תמיסה, שכן ניתן להסיר את תוצר הלוואי שלו אוריאה על ידי כביסה במהלך עיבוד מימי . [12]

HOBt
HOAt
השפעה קבוצתית שכנה של HOAt

הפעלת Carbodiimide פותחת את האפשרות ל- racemization של חומצת האמינו הפעילה. [12] ניתן לעקוף את הגזע באמצעות תוספים 'מדכאי גזע' כגון הטריאזולים 1-hydroxy-benzotriazole (HOBt), ו -1-hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt). ריאגנטים אלה תוקפים את תוצר הביניים O - acylisourea ליצירת אסטר פעיל , אשר מגיב לאחר מכן עם הפפטיד ליצירת הקשר הפפטיד הרצוי. [16] אתיל ציאנוהידרוקסיאימינואצטט (אוקסימה), תוסף לצימוד קרבודיאימיד, פועל כחלופה ל-HOAt. [17]

מלחי אמיניום/אורוניום ופוספוניום

ריאגנטים לצימוד פפטידים על בסיס אורוניום

ריאגנטים מצמדים מסוימים משמיטים את הקרבודיאימיד לחלוטין ומשלבים את חלק ה-HOAt/HOBt כמלח אמיניום/אורוניום או פוספון של אניון לא נוקלאופילי ( טטרה - פלואורובוראט או הקספלואורופוספט ). [11] דוגמאות לראגנטים של אמיניום/אורוניום כוללות HATU (HOAT), HBTU / TBTU (HOBt) ו- HCTU (6-ClHOBt). HBTU ו-TBTU נבדלים רק בבחירת האניון. ריאגנטים של פוספוניום כוללים PyBOP (HOBt) ו- PyAOP (HOAT).

ריאגנטים אלה יוצרים את אותו מין אסטר פעיל כמו תנאי ההפעלה של קרבודיאימיד, אך שונים זה מזה בקצב שלב ההפעלה הראשוני, אשר נקבע על פי אופי שלד הפחמן של מגיב הצימוד. [18] יתר על כן, ריאגנטים של מיניום/אורוניום מסוגלים להגיב עם הפפטיד N-terminus ליצירת תוצר לוואי לא פעיל של גואנידינו, ואילו ריאגנטים של פוספוניום אינם .

חומצה פרופנפוספונית אנהידריד

מאז סוף שנות ה-2000, אנהידריד חומצה פרופנפוספונית , הנמכרת מסחרית תחת שמות שונים כגון "T3P", הפכה למגיב שימושי ליצירת קשרים אמידים ביישומים מסחריים. הוא הופך את החמצן של החומצה הקרבוקסילית לקבוצה עוזבת, שתוצרי הלוואי של צימוד הפפטידים מסיסים במים וניתנים לשטיפה בקלות. בהשוואת ביצועים בין אנהידריד חומצה פרופנפוספונית לבין ריאגנטים אחרים של צימוד פפטידים להכנת תרופה לא-פפטידית, נמצא כי מגיב זה עדיף על ריאגנטים אחרים בכל הנוגע לתפוקה ואפימריזציה נמוכה. [19]

תומך מוצק

פוליסטירן צולב הוא התומך המוצק הנפוץ ביותר בשימוש ב-SPPS.

תומכים מוצקים לסינתזת פפטידים נבחרים ליציבות פיזית, כדי לאפשר סינון מהיר של נוזלים. תומכים מתאימים אינרטים לגיבים ולממסים המשמשים במהלך SPPS, אם כי עליהם להתנפח בממסים המשמשים כדי לאפשר חדירת הריאגנטים, ולאפשר הצמדת חומצת האמינו הראשונה. [20]

שלושה סוגים עיקריים של תומכים מוצקים הם: תומכים מסוג ג'ל, תומכים מסוג משטח וחומרים מרוכבים. [20] שיפורים בתומכים מוצקים המשמשים לסינתזת פפטידים משפרים את יכולתם לעמוד בשימוש החוזר ב-TFA במהלך שלב ההסרה של SPPS. [21] משתמשים בשני שרפים ראשוניים, בהתבסס על האם רצוי חומצה קרבוקסילית או אמידה סופנית. שרף וואנג היה, נכון לשנת 1996 , השרף הנפוץ ביותר עבור פפטידים עם חומצות קרבוקסיליות סופניות. [22] [ צריך עדכון ]

תוכניות הגנה על קבוצות

כפי שתואר לעיל, השימוש בקבוצות הגנה N-טרמינליות ושרשרת צד חיוני במהלך סינתזת פפטידים כדי למנוע תגובות לוואי לא רצויות, כגון צימוד עצמי של חומצת האמינו הפעילה המובילה ל ( פילמור ). [1] זה יתחרה בתגובת הצימוד הפפטידית המיועדת, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה או אפילו כישלון מוחלט בסינתזה של הפפטיד הרצוי.

קיימות שתי ערכות עיקריות של קבוצות הגנה אורתוגונליות לשימוש בסינתזה של פפטידים בשלב מוצק: מה שנקרא גישות Boc/Bzl ו-Fmoc/ t Bu. [2] אסטרטגיית Boc/Bzl משתמשת בהגנה על N-terminal Boc לאביל TFA לצד הגנת שרשרת צד המוסרת באמצעות מימן פלואוריד נטול מים במהלך שלב המחשוף הסופי (עם ביקוע סימולטני של הפפטיד מהתומך המוצק). Fmoc/tBu SPPS משתמשת בהגנה Fmoc N-terminal-base-labile , עם הגנה על שרשרת צד וקישור שרף שאינם עמידים בחומצה (המחשוף החומצי הסופי מתבצע באמצעות טיפול TFA).

שתי הגישות, כולל היתרונות והחסרונות של כל אחת מהן, מתוארות בפירוט רב יותר להלן.

Boc/Bzl SPPS

מחשוף של קבוצת בוק

שיטות ישנות יותר לסינתזת פפטידים לפני הופעת SPSS הסתמכו על tert -butyloxycarbonyl (בקיצור 'Boc') כקבוצת הגנה זמנית על N-termine α-amino. קבוצת Boc מוסרת עם חומצה, כגון חומצה טריפלואורית (TFA). זה יוצר קבוצת אמינו טעינה חיובית בנוכחות עודף TFA (שימו לב שקבוצת האמינו אינה פרוטונרית בתמונה מימין), אשר מנוטרלת ומקושרת לחומצת האמינו הפעילה הנכנסת. [23] ניטרול יכול להתרחש לפני הצימוד או באתרו במהלך תגובת הצימוד הבסיסית.

גישת Boc/Bzl שומרת על שימושיותה בהפחתת צבירת פפטידים במהלך הסינתזה. [24] בנוסף, Boc/Bzl SPPS עשוי להיות מועדף על פני גישת Fmoc/ t Bu בעת סינתזה של פפטידים המכילים חלקים רגישים לבסיס (כגון depsipeptides ), מכיוון שנדרש טיפול בבסיס במהלך שלב הסרת ההגנה של Fmoc (ראה להלן).

קבוצות הגנה קבועות על שרשרת צד המשמשות במהלך Boc/Bzl SPPS הן בדרך כלל קבוצות מבוססות בנזיל או בנזיל. [1] הסרה סופית של הפפטיד מהתומך המוצק מתרחשת בו-זמנית עם הסרת ההגנה של שרשרת הצד באמצעות מימן פלואוריד נטול מים באמצעות מחשוף הידרוליטי. התוצר הסופי הוא מלח פלואוריד שקל יחסית להמיס אותו. יש להוסיף ל-HF חומרי נבלות כגון קרסול על מנת למנוע קטיוני t- בוטיל תגובתיים ליצור מוצרים לא רצויים. חסרון של גישה זו הוא הפוטנציאל לפירוק של הפפטיד על ידי מימן פלואוריד.

Fmoc/ t Bu SPPS

מחשוף של קבוצת Fmoc. טיפול באמין המוגן Fmoc עם piperidine מביא להפשטה של ​​פרוטונים מקבוצת המתין של מערכת הטבעת הפלואורינית . זה מוביל לשחרור של קרבמט , שמתפרק לפחמן דו חמצני ( CO 2 ) והאמין החופשי. נוצר גם דיבנזופולבן . תגובה זו מסוגלת להתרחש עקב החומציות של הפרוטון הפלואוריניל , הנובעת מהתייצבות האניון הארומטי שנוצר. תוצר הלוואי של dibenzofulvene יכול להגיב עם נוקלאופיליםכמו ה-piperidine (שיש עודף גדול), או אולי האמין המשוחרר. [25]

השימוש בהגנה N-terminal Fmoc מאפשר שיטת ביטול הגנה מתונה יותר מאשר בשימוש עבור Boc/Bzl SPPS, ותכנית הגנה זו היא באמת אורתוגונלית בתנאי SPPS. ביטול ההגנה של Fmoc משתמש בבסיס, בדרך כלל 20-50% פיפרידין ב- DMF . [20] לכן האמין החשוף הוא ניטרלי, וכתוצאה מכך לא נדרש נטרול של השרף הפפטיד, כמו במקרה של גישת Boc/Bzl. היעדר דחייה אלקטרוסטטית בין שרשראות הפפטידים יכול להוביל לסיכון מוגבר להצטברות עם Fmoc/ tBu SPPS לעומת זאת. מכיוון שקבוצת הפלואורניל המשוחררת היא כרומופור, ניתן לעקוב אחר ביטול ההגנה של Fmoc על ידי ספיגת UV של תערובת התגובה, אסטרטגיה המופעלת בסינתיסייזרים אוטומטיים של פפטידים.

היכולת של קבוצת Fmoc להתפצל בתנאים בסיסיים מתונים יחסית תוך היותה יציבה לחומצה מאפשרת שימוש בקבוצות הגנה על שרשרת צד כמו Boc ו- t Bu שניתן להסיר בתנאי ביקוע סופי חומצי מתונים יותר (TFA) מאלה המשמשים עבור מחשוף סופי ב-Boc/Bzl SPPS (HF). חומרי נבלות כגון מים וטריאיזופרופילסילאן (TIPS) מתווספים במהלך המחשוף הסופי על מנת למנוע תגובות לוואי עם מינים קטיוניים תגובתיים המשתחררים כתוצאה מהסרת ההגנה של שרשרת הצד. הפפטיד הגולמי המתקבל מתקבל כמלח TFA, שעלול להיות קשה יותר להמסה מאשר מלחי הפלואור הנוצרים ב-Boc SPPS.

Fmoc/ t Bu SPPS הוא פחות חסכוני באטומים, מכיוון שקבוצת הפלואורניל גדולה בהרבה מקבוצת Boc. בהתאם לכך, המחירים של חומצות אמינו Fmoc היו גבוהים עד שהחל הפיילוט בקנה מידה גדול של אחת מתרופות הפפטידים המסונתזות הראשונות, enfuvirtide , בשנות ה-90, כאשר הביקוש בשוק התאים את המחירים היחסיים של חומצות אמינו Fmoc- לעומת Boc.

קבוצות הגנה אחרות

בנזילוקסי-קרבוניל

קבוצת (Z) היא קבוצה נוספת המגנה על אמינים מסוג קרבמט, שהתגלתה על ידי ליאונידס זרוואס בתחילת שנות ה-30 והוספה בדרך כלל באמצעות תגובה עם בנזיל כלורופורמט . [26]

הכנסת קבוצת ההגנה Z מפני תגובה עם בנזיל כלורופורמט (Z-כלוריד)

הוא מוסר בתנאים קשים באמצעות HBr בחומצה אצטית , או תנאים מתונים יותר של הידרוגנציה קטליטית .

מתודולוגיה זו שימשה לראשונה בסינתזה של אוליגופפטידים על ידי Zervas ומקס ברגמן בשנת 1932. [27] לפיכך, זו נודעה בשם סינתזת Bergmann-Zervas, אשר אופיינה "יצירת עידן" וסייעה לבסס כימיה של פפטידים סינתטיים כחומר מובהק. שדה. [26] היא היוותה את שיטת המעבדה השימושית הראשונה לסינתזת פפטידים מבוקרת, המאפשרת סינתזה של פפטידים שלא ניתן היה להשיג בעבר עם שרשראות צד ריאקטיביות, בעוד שחומצות אמינו מוגנות ב-Z נמנעות גם מהן עוברות גזע . [26] [27]

השימוש בשיטת Bergmann-Zervas נשאר הנוהג המקובל בכימיה של פפטידים במשך שני עשורים תמימים לאחר פרסומו, והוחלפו על ידי שיטות חדשות יותר (כגון קבוצת ההגנה של Boc) בתחילת שנות ה-50. [26] כיום, בעוד שהוא שימש מעת לעת להגנה על α-amine, הוא משמש הרבה יותר להגנה על שרשרת צד.

הקצאת קבוצות שונות

קבוצת ההגנה של אלילוקסיקרבוניל (alloc) משמשת לפעמים להגנה על קבוצת אמינו (או חומצה קרבוקסילית או קבוצת אלכוהול) כאשר נדרשת ערכת הסרת הגנה אורתוגונלית . הוא משמש לפעמים גם בעת ביצוע היווצרות פפטיד מחזורי על שרף, כאשר הפפטיד מקושר לשרף על ידי קבוצה תפקודית של שרשרת צדדית. ניתן להסיר את קבוצת Alloc באמצעות טטרקיס(טריפנילפוספין) פלדיום(0) . [28]

עבור יישומים מיוחדים כמו שלבים סינתטיים הכוללים מיקרו-מערכי חלבון , משתמשים בקבוצות הגנה הנקראות לפעמים "ליטוגרפיות", הניתנות לפוטוכימיה באורך גל מסוים של אור, ולכן ניתן להסירן במהלך סוגי ליטוגרפיים של פעולות. [29] [30] [31] [32]

יצירת קשר דיסולפיד רגיו-סלקטיבי

היווצרותם של דיסולפידים מקומיים מרובים נותרה מאתגרת של סינתזת פפטידים מקורית בשיטות שלב מוצק. שילוב שרשרת אקראי מביא בדרך כלל למספר מוצרים עם קשרי דיסולפיד שאינם מקוריים. [33] יצירה שלבית של קשרי דיסולפיד היא בדרך כלל השיטה המועדפת, ומתבצעת עם קבוצות הגנה על תיול. [34] קבוצות מגנות תיול שונות מספקות מימדים מרובים של הגנה אורתוגונלית. ציסטינים מוגנים אורתוגונלית אלו משולבים במהלך סינתזה של הפפטיד בשלב מוצק. הסרה רצופה של קבוצות אלו, כדי לאפשר חשיפה סלקטיבית של קבוצות תיול חופשיות, מובילה להיווצרות דיסולפידים באופן שלבים. יש להתייחס לסדר ההסרה של הקבוצות כך שרק קבוצה אחת תוסר בכל פעם.

קבוצות הגנה על תיול המשמשות בסינתזה של פפטידים הדורשות יצירת קשרים דיסולפידים אזורסלקטיביים מאוחרים יותר חייבות להיות בעל מאפיינים מרובים. [35] [36] ראשית, עליהם להיות הפיכים בתנאים שאינם משפיעים על שרשראות הצדדיות הבלתי מוגנות. שנית, הקבוצה המגנה חייבת להיות מסוגלת לעמוד בתנאים של סינתזה מוצק. שלישית, הסרת קבוצת ההגנה של תיול חייבת להיות כזו שתותיר קבוצות הגנה אחרות של תיול ללא פגע, אם רצוי הגנה אורתוגונלית. כלומר, הסרת PG A לא אמורה להשפיע על PG B. חלק מקבוצות ההגנה על תיול הנפוצות כוללות את האצטמידו-מתיל (Acm), tert-butyl (But), 3-nitro-2-pyridine sulfenyl (NPYS), 2- קבוצות פירידין-סולפניל (Pyr), וטריטיל (Trt). [35]חשוב לציין, קבוצת NPYS יכולה להחליף את Acm PG כדי להניב תיול מופעל. [37]

בשיטה זו, קיסו ועמיתיו דיווחו על הסינתזה הכוללת הראשונה של אינסולין בשנת 1993. [38] בעבודה זו, שרשרת A של אינסולין הוכנה עם קבוצות הגנה הבאות על הציסטאין שלה: CysA6(But), CysA7(Acm ), ו-CysA11(אבל), ומשאיר את CysA20 לא מוגן. [38]

סינתזת פפטידים בעזרת מיקרוגל

נעשה שימוש בסינתזה של פפטידים בעזרת מיקרוגל להשלמת רצפי פפטידים ארוכים עם דרגות תשואה גבוהות ודרגות נמוכות של גזע. [39] [40]

סינתזה של פפטידים ארוכים

התארכות שלבית, שבה חומצות האמינו מחוברות שלב אחר שלב בתורן, אידיאלית עבור פפטידים קטנים המכילים בין 2 ל-100 שאריות חומצות אמינו. שיטה נוספת היא עיבוי מקטעים , בה מצמידים שברי פפטידים. למרות שהראשונים יכולים להאריך את שרשרת הפפטידים ללא גזע , התשואה יורדת אם רק משתמשים בו ליצירת פפטידים ארוכים או קוטביים מאוד. עיבוי שברים עדיף על התארכות שלבית לסינתזה של פפטידים ארוכים ומתוחכמים, אך יש להגביל את השימוש בו כדי להגן מפני גזע. עיבוי שברים גם הוא לא רצוי מכיוון שהשבר המצורף חייב להיות עודף גולמי, מה שעשוי להיות מגבלה בהתאם לאורך השבר. [41]

פיתוח חדש לייצור שרשראות פפטידים ארוכות יותר הוא קשירה כימית : שרשראות פפטידים לא מוגנות מגיבות בצורה כימוסלקטיבית בתמיסה מימית. מוצר מבוקר קינטית ראשון מתארגן מחדש ליצירת הקשר האמיד. הצורה הנפוצה ביותר של קשירה כימית מקורית משתמשת בתיואסטר פפטיד המגיב עם שארית ציסטאין סופנית. [42]

שיטות אחרות הישימות לקישור קוולנטי של פוליפפטידים בתמיסה מימית כוללות שימוש במעיים מפוצלים , [ 43] יצירת קשר איזופפטידים ספונטני [44] וקשירת סוגאזיס . [45]

על מנת לייעל את הסינתזה של פפטידים ארוכים , פותחה בעמק מדיקון שיטה להמרת רצפי פפטידים . [ צריך ציטוט ] הרצף הקדום הפשוט (למשל ליזין (Lysn); חומצה גלוטמית (Glun); (LysGlu)n) המשולבת בקצה ה- C של הפפטיד כדי לגרום למבנה דמוי אלפא סליל . זה עשוי להגדיל את זמן מחצית החיים הביולוגי , לשפר את יציבות הפפטידים ולעכב פירוק אנזימטי מבלי לשנות את הפעילות הפרמקולוגית או פרופיל הפעולה. [46] [47]

פפטידים מחזוריים

על מחזור שרף

ניתן לבצע מחזור פפטידים על תמיכה מוצקה. ניתן להשתמש במגוון ריאגנטים למחזוריות כגון HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. [48] ​​ניתן ליצור פפטידים ראש אל זנב על התומך המוצק. הסרת ההגנה של קצה ה-C בנקודה מתאימה כלשהי מאפשרת מחזור על-שרף על ידי יצירת קשר אמידי עם ה-N-terminus שהוסר. לאחר שהתרחש מחזוריות, הפפטיד מבוקע מהשרף על ידי אסידוליזה ומטוהר. [ צריך ציטוט ]

האסטרטגיה לסינתזה בשלב מוצק של פפטידים מחזוריים אינה מוגבלת לחיבור דרך שרשראות צד של Asp, Glu או Lys. לציסטאין יש קבוצת sulfhydryl מגיבה מאוד בשרשרת הצדדית שלו. גשר דיסולפיד נוצר כאשר אטום גופרית מציסטאין אחד יוצר קשר קוולנטי יחיד עם אטום גופרית אחר מציסטאין שני בחלק אחר של החלבון. גשרים אלו עוזרים לייצב חלבונים, במיוחד אלו המופרשים מהתאים. יש חוקרים שמשתמשים בציסטאין שונה באמצעות S-acetomidomethyl (Acm) כדי לחסום את היווצרות הקשר הדיסולפיד אך לשמר את הציסטאין ואת המבנה הראשוני המקורי של החלבון. [49]

מחזוריות מחוץ לשרף

מחזוריות מחוץ לשרף היא סינתזה בשלב מוצק של תוצרי ביניים מרכזיים, ואחריה מחזור המפתח בשלב התמיסה, הסרת ההגנה הסופית של כל שרשראות צד מכוסות מבוצעת גם בשלב התמיסה. יש לזה את החסרונות שהיעילות של סינתזת פאזה מוצקה אובדת בשלבי שלב התמיסה, שנדרש טיהור מתוצרי לוואי, ריאגנטים וחומר לא מומר, ושניתן להיווצר אוליגומרים לא רצויים אם מעורבת היווצרות מקרו -מחזור. [50]

השימוש באסטרים של פנטפלואורופניל (FDPP, [51] PFPOH [52] ) ו-BOP-Cl [53] שימושיים עבור מחזור פפטידים.

ראה גם

הפניות

  1. ^ a b c d Isidro-Llobet A, Alvarez M, Albericio F (יוני 2009). "קבוצות הגנה על חומצות אמינו". ביקורות כימיות . 109 (6): 2455–2504. doi : 10.1021/cr800323s . hdl : 2445/69570 . PMID 19364121 . 
  2. ^ a b c d e f g h Chan WC, White PD (2000). Fmoc Solid Phase פפטיד סינתזה: גישה מעשית . אוקספורד, בריטניה: OUP. ISBN 978-0-19-963724-9.
  3. ^ Jaradat DM (ינואר 2018). "שלושה עשר עשורים של סינתזת פפטידים: התפתחויות מפתח בסינתזת פפטידים בשלב מוצק ויצירת קשרי אמיד המשמשים בקשירת פפטידים". חומצות אמינו . 50 (1): 39–68. doi : 10.1007/s00726-017-2516-0 . PMID 29185032 . S2CID 3680612 .  
  4. ^ Merrifield RB (1963). "סינתזת פפטיד שלב מוצק. I. סינתזה של טטרפפטיד". ריבה. Chem. Soc. 85 (14): 2149–2154. doi : 10.1021/ja00897a025 .
  5. ^ מיטשל AR (2008). "ברוס מריפילד וסינתזת פפטידים בשלב מוצק: הערכה היסטורית" . ביופולימרים . 90 (3): 175–184. doi : 10.1002/bip.20925 . PMID 18213693 . S2CID 30382016 .  
  6. ^ Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, et al. (2007). "ניתוח HPLC וטיהור של פפטידים". אפיון פפטידים ופרוטוקולי יישום . שיטות בביולוגיה מולקולרית. כרך. 386. הוצאת הומנה. עמ' 3–55. doi : 10.1007/978-1-59745-430-8_1 . ISBN 978-1-59745-430-8. PMC  7119934 . PMID  18604941 .
  7. ^ "שירות סינתזת פפטידים מותאם אישית. HPLC מתייחס לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים" . Remetide Biotech . נובמבר 2021.
  8. ^ Lundemann-Hombourger O (מאי 2013). "צמח הפפטידים האידיאלי" (PDF) . מגזין כימיקלים מיוחדים : 30–33.
  9. ^ Tickler AK, Clippingdale AB, Wade JD (אוגוסט 2004). "עמילואיד-בטא כ"רצף קשה" בסינתזה של פפטידים בשלב מוצק". אותיות חלבון ופפטידים . 11 (4): 377–384. דוי : 10.2174/0929866043406986 . PMID 15327371 . 
  10. ^ כדי להמחיש את ההשפעה של תשואות צימוד לא אופטימליות עבור סינתזה נתונה, שקול את המקרה שבו כל שלב צימוד היה אמור לקבל לפחות 99% תשואה: זה יביא לתשואה גולמית כוללת של 77% עבור פפטיד בן 26 חומצות אמינו (בהנחה של 100 % תשואה בכל ביטול הגנה); אם כל צימוד היה יעיל ב-95%, התשואה הכוללת תהיה 25%.
  11. ^ a b El-Faham A, Albericio F (נובמבר 2011). "ריאגנטים לצימוד פפטיד, יותר ממרק אותיות". ביקורות כימיות . 111 (11): 6557–6602. doi : 10.1021/cr100048w . PMID 21866984 . 
  12. ^ a b c d e Montalbetti CA, Falque V (2005). "יצירת קשר אמידים וצימוד פפטיד". טטרהדרון . 61 (46): 10827–10852. doi : 10.1016/j.tet.2005.08.031 .
  13. ^ Valeur E, Bradley M (פברואר 2009). "יצירת קשר אמיד: מעבר למיתוס של ריאגנטים צימודים". חוות דעת של החברה הכימית . 38 (2): 606–631. doi : 10.1039/B701677H . PMID 19169468 . 
  14. ^ El-Faham A, Albericio F (נובמבר 2011). "ריאגנטים לצימוד פפטיד, יותר ממרק אותיות". ביקורות כימיות . 111 (11): 6557–6602. doi : 10.1021/cr100048w . PMID 21866984 . 
  15. ^ Singh S (ינואר 2018). "CarboMAX - צימוד פפטיד משופר בטמפרטורות גבוהות" (PDF) . הערה AP . 0124 : 1–5.
  16. ^ Joullié MM, Lassen KM (2010). "אבולוציה של היווצרות בונד אמיד" . Arkivoc . viii (8): 189–250. doi : 10.3998/ark.5550190.0011.816 .
  17. ^ Subirós-Funosas R, Prohens R, Barbas R, El-Faham A, Albericio F (ספטמבר 2009). "אוקסימה: תוסף יעיל לסינתזת פפטידים להחלפת ה-HOBt וה-HOAt המבוססים על בנזוטריאזול עם סיכון נמוך יותר לפיצוץ". כימיה . 15 (37): 9394–9403. doi : 10.1002/chem.200900614 . PMID 19575348 . 
  18. ^ Albericio F, Bofill JM, El-Faham A, Kates SA (1998). "שימוש בריאגנטים מצמדים המבוססים על מלח אוניום בסינתזת פפטידים". J. Org. Chem . 63 (26): 9678–9683. doi : 10.1021/jo980807y .
  19. ^ J. Hiebl et al, J. Pept. מילון (1999), 54, 54
  20. ^ a b c Albericio F (2000). סינתזה מוצקה: מדריך מעשי (מהדורה 1). בוקה רטון: CRC Press. ע. 848. ISBN 978-0-8247-0359-2.
  21. ^ Feinberg RS, Merrifield RB (1974). "כלורומתילציה מזורזת של אבץ כלוריד של שרפים לסינתזת פפטידים בשלב מוצק". טטרהדרון . 30 (17): 3209–3212. doi : 10.1016/S0040-4020(01)97575-1 .
  22. ^ Hermkens PH, Ottenheijm HC, Rees DC (1997). "תגובות אורגניות בשלב מוצק II: סקירה של הספרות 95 נובמבר - נובמבר 96". טטרהדרון . 53 (16): 5643–5678. doi : 10.1016/S0040-4020(97)00279-2 .
  23. ^ Schnolzer MA, Jones A, Alewood D, Kent SB (2007). "נטרול באתרו בסינתזת פפטידים מוצקים ב-Boc-chemistry". Int. J. Peptide Res. טיפול . 13 (1–2): 31–44. doi : 10.1007/s10989-006-9059-7 . S2CID 28922643 . 
  24. ^ Beyermann M, Bienert M (1992). "סינתזה של רצפי פפטידים קשים: השוואה של טכניקת Fmoc ו-BOC". אותיות טטרהדרון . 33 (26): 3745–3748. doi : 10.1016/0040-4039(92)80014-B .
  25. ^ ג'ונס ג'יי (1992). סינתזת חומצות אמינו ופפטידים . אוקספורד, בריטניה: הוצאת אוניברסיטת אוקספורד.
  26. ^ a b c d Katsoyannis PG, ed. (1973). הכימיה של פוליפפטידים . ניו יורק: הוצאת המליאה. doi : 10.1007/978-1-4613-4571-8 . ISBN 978-1-4613-4571-8. S2CID  35144893 .
  27. ^ a b Bergmann M , Zervas L (1932). "Über ein allgemeines Verfahren der Peptid-Synthese". Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft . 65 (7): 1192–1201. doi : 10.1002/cber.19320650722 .
  28. ^ Thieriet N, Alsina J, Giralt E, Guibé F, Albericio F (1997). "שימוש בחומצות אמינו של Alloc בסינתזת פפטידים בשלב מוצק. תגובות צימוד של ביטול הגנה באמצעות תנאים ניטרליים". אותיות טטרהדרון . 38 (41): 7275–7278. doi : 10.1016/S0040-4039(97)01690-0 .
  29. ^ Shin DS, Kim DH, Chung WJ, Lee YS (ספטמבר 2005). "סינתזת פפטיד שלב מוצק קומבינטורית ומבחני ביו". כתב עת לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית . 38 (5): 517–525. doi : 10.5483/BMBRep.2005.38.5.517 . PMID 16202229 . 
  30. ^ Price JV, Tangsombatvisit S, Xu G, Yu J, Levy D, Baechler EC, et al. (ספטמבר 2012). "על מערכי סיליקו פפטיד למיפוי ברזולוציה גבוהה של אפיטופים של נוגדנים ואינטראקציות חלבון-חלבון מגוונות" . רפואת טבע . 18 (9): 1434–1440. doi : 10.1038/nm.2913 . PMC 3491111 . PMID 22902875 .  
  31. ^ Hedberg-Dirk EL, Martinez UA (8 באוגוסט 2010). "מערכי חלבון בקנה מידה גדול שנוצרו עם ליטוגרפיה אינטרפרומטרית לבקרה מרחבית של אינטראקציות בין תא לחומר" . כתב עת לננו-חומרים . 2010 : e176750. דואי : 10.1155/2010/176750 . ISSN 1687-4110 . 
  32. ^ Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D (פברואר 1991). "סינתזה כימית מקבילה מכוונת אור, ניתנת להתייחסות מרחבית". מדע . 251 (4995): 767–773. Bibcode : 1991Sci...251..767F . doi : 10.1126/science.1990438 . PMID 1990438 . 
  33. ^ Tam JP, Wu CR, Liu W, Zhang JW (1991). "יצירת קשר דיסולפיד בפפטידים על ידי דימתיל סולפוקסיד. היקף ויישומים". ריבה. Chem. Soc . 113 (17): 6657–6662. doi : 10.1021/ja00017a044 .
  34. ^ Sieber P, Kamber B, Hartmann A, Jöhl A, Riniker B, Rittel W (ינואר 1977). "[סינתזה כוללת של אינסולין אנושי. IV. תיאור השלבים הסופיים (תרגום המחבר)]". Helvetica Chimica Acta . 60 (1): 27–37. doi : 10.1002/hlca.19770600105 . PMID 838597 . 
  35. ^ a b Spears RJ, McMahon C, Chudasama V (אוקטובר 2021). "קבוצות הגנה על ציסטאין: יישומים במדעי הפפטידים והחלבון". חוות דעת של החברה הכימית . 50 (19): 11098–11155. doi : 10.1039/D1CS00271F . PMID 34605832 . S2CID 238258277 .  
  36. ^ Laps S, Atamleh F, Kamnesky G, Sun H, Brik A (פברואר 2021). "אסטרטגיה סינתטית כללית להיווצרות אולטרה-מהירה אזורסלקטיבית של קשרי דיסולפיד בפפטידים וחלבונים" . תקשורת טבע . 12 (1): 870. Bibcode : 2021NatCo..12..870L . doi : 10.1038/s41467-021-21209-0 . PMC 7870662 . PMID 33558523 .  
  37. ^ Ottl J, Battistuta R, Pieper M, Tschesche H, Bode W, Kühn K, Moroder L (נובמבר 1996). "תכנון וסינתזה של פפטידים הטרוטרימריים של קולגן עם קשר ציסטין מובנה. מודלים לקטבוליזם של קולגן על ידי מטריקס-מטלופרוטאזות". מכתבי FEBS . 398 (1): 31–36. doi : 10.1016/S0014-5793(96)01212-4 . PMID 8946948 . S2CID 24688988 .  
  38. ^ a b Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y (1993). "סינתזה כוללת של אינסולין אנושי על ידי יצירת דיסולפידים ריגיוסלקטיבית בשיטת סיליל כלוריד-סולפוקסיד". כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיה . 115 (24): 11384–11392. doi : 10.1021/ja00077a043 .
  39. ^ Pedersen SL, Tofteng AP, Malik L, Jensen KJ (מרץ 2012). "חימום מיקרוגל בסינתזת פפטידים בשלב מוצק". חוות דעת של החברה הכימית . 41 (5): 1826–1844. doi : 10.1039/C1CS15214A . PMID 22012213 . 
  40. ^ Kappe CO, Stadler A, Dallinger D (2012). מיקרוגלים בכימיה אורגנית ותרופתית . שיטות ועקרונות בכימיה רפואית. כרך. 52 (מהדורה שנייה). ווילי. ISBN 9783527331857.
  41. ^ Nyfeler R (7 בנובמבר 1994). סינתזת פפטידים באמצעות עיבוי מקטעים . שיטות בביולוגיה מולקולרית. כרך. 35. ניו ג'רזי: Humana Press. עמ' 303–316. doi : 10.1385/0-89603-273-6:303 . ISBN 978-0-89603-273-6. PMID  7894607 .
  42. ^ Flood DT, Hintzen JC, Bird MJ, Cistrone PA, Chen JS, Dawson PE (ספטמבר 2018). "מינוף סינתזת קנור פיראזול ליצירת קלה של ת'יאסטר פונדקאיות לשימוש בקשירה כימית מקורית" . Angewandte Chemie (עורך בינלאומי באנגלית) . 57 (36): 11634–11639. doi : 10.1002/anie.201805191 . PMC 6126375 . PMID 29908104 .  
  43. ^ Aranko AS, Wlodawer A, Iwaï H (אוגוסט 2014). "המתכון של הטבע לפיצול מעיים" . הנדסת חלבון, עיצוב ובחירה . 27 (8): 263–271. doi : 10.1093/protein/gzu028 . PMC 4133565 . PMID 25096198 .  
  44. ^ Reddington SC, Howarth M (דצמבר 2015). "סודות של אינטראקציה קוולנטית לביו-חומרים וביוטכנולוגיה: SpyTag ו- SpyCatcher" . דעה נוכחית בביולוגיה כימית . 29 : 94–99. doi : 10.1016/j.cbpa.2015.10.002 . PMID 26517567 . 
  45. ^ Haridas V, Sadanandan S, Dheepthi NU (ספטמבר 2014). "אסטרטגיות ביו-אורגניות מבוססות סורטאז לסינתזה מקרומולקולרית". ChemBioChem . 15 (13): 1857–1867. doi : 10.1002/cbic.201402013 . PMID 25111709 . S2CID 28999405 .  
  46. ^ Kapusta DR, Thorkildsen C, Kenigs VA, Meier E, Vinge MM, Quist C, Petersen JS (אוגוסט 2005). "אפיון פרמקודינמי של ZP120 (Ac-RYYRWKKKKKKK-NH2), אגוניסט חלקי לקולטן פפטיד נוציצפטין/אורפנין FQ סלקטיבי פונקציונלי עם פעילות אקוורטית חוסכת נתרן-אשלגן". כתב העת לפרמקולוגיה וטיפול ניסיוני . 314 (2): 652–660. doi : 10.1124/jpet.105.083436 . PMID 15855355 . S2CID 27318583 .  
  47. ^ Rizzi A, Rizzi D, Marzola G, Regoli D, Larsen BD, Petersen JS, Calo' G (אוקטובר 2002). "אפיון תרופתי של ליגנד קולטן נוציצפטין/אורפנין FQ החדש, ZP120: מחקרים במבחנה ו-in vivo בעכברים" . כתב העת הבריטי לפרמקולוגיה . 137 (3): 369–374. doi : 10.1038/sj.bjp.0704894 . PMC 1573505 . PMID 12237257 .  
  48. ^ דייויס JS (אוגוסט 2003). "המחזוריות של פפטידים ודפסיפפטידים" . Journal of Peptide Science . 9 (8): 471–501. doi : 10.1002/psc.491 . PMID 12952390 . 
  49. ^ Sieber P, Kamber B, Riniker B, Rittel W (10 בדצמבר 1980). "חמצון יוד של S-Trityl- ו-S-Acetamidomethyl-cysteine-peptides המכילים טריפטופן: תנאים המובילים להיווצרות טריפטופן-2-תיואתרים" . Helvetica Chimica Acta . 63 (8): 2358–2363. doi : 10.1002/hlca.19800630826 . אוחזר ב-1 בנובמבר 2021 .
  50. ^ Scott P (13 באוקטובר 2009). אסטרטגיות קישור בסינתזה אורגנית בשלב מוצק . ג'ון ווילי ובניו. עמ' 135–137. ISBN 978-0-470-74905-0.
  51. ^ Nicolaou KC, Natarajan S, Li H, Jain NF, Hughes R, Solomon ME, et al. (אוקטובר 1998). "סינתזה כוללת של Vancomycin Aglycon-Part 1: סינתזה של חומצות אמינו 4-7 ובניית שלד הטבעת AB-COD". Angewandte Chemie . 37 (19): 2708–2714. doi : 10.1002/(SICI)1521-3773(19981016)37:19<2708::AID-ANIE2708>3.0.CO;2-E . PMID 29711605 . 
  52. ^ East SP, Joullié MM (1998). "מחקרים סינתטיים של אלקלואידים ציקלופפטידים בעלי 14 איברים". טטרהדרון Lett. 39 (40): 7211–7214. doi : 10.1016/S0040-4039(98)01589-5 .
  53. ^ Baker R, Castro JL (1989). "הסינתזה הכוללת של (+)-מקבצין I". Chem. Commun. (6): 378–381. doi : 10.1039/C39890000378 .

קריאה נוספת

קישורים חיצוניים